# 质控
nohup fastqc -o /data2/chy/Rice/rawdata/dml4_3 DML4_C1_Clean_Data1.fq.gz DML4_C1_Clean_Data2.fq.gz &

# hisat2比对
# 安装
wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/hisat2-2.0.0-beta-source.zip
unzip hisat2-2.0.0-beta-source.zip

# hisat2构建索引
# 需要Python2.7以上
extract_exons.py Homo_sapiens.GRCh38.83.chr.gtf > genome.exon
extract_splice_sites.py Homo_sapiens.GRCh38.83.chr.gtf > genome.ss
extract_snps.py snp142Common.txt > genome.snp
hisat2-build -p 4 genome.fa --snp genome.snp --ss genome.ss --exon genome.exon genome_snp_tran

# 比对
hisat2 -p 10 --dta -x ./human_genome/Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome.1_tran -1 SRR5159863_1.fastq -2 SRR5159863_2.fastq -S ./data_sam/SRR5159863.sam

# sam转bam文件
samtools sort -@ 9 -o ./data_sam/SRR5159863.bam ./data_sam/SRR5159863.sam

# Stringtie组装定量
# 安装
wget http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/stringtie-2.1.4.tar.gz
tar zxf stringtie-2.1.tar.gz
make release
# 运行(输入文件为sort后的bam文件)
stringtie -e -B -p 20 -G ./human_genome/Homo_sapiens.GRCh38.92.chr.gtf -o ./data_ballgown/mRNA_dta.gtf -A ./data_gene/mRNA_SRR5159863_abun.txt ./data_sam/SRR5159863.bam
主要参数：
-G 参考基因组注释文件
-o 输出文件名
-l 输出文件前缀
-p 线程数
-m 转录本最小长度
-B 输出可用于Ballgown分析的文件
-e 仅评估参考基因组注释文件中的转录本丰度

结果gtf文件：
seqname:该转录本所在的染色体号，contig或scaffold;
source:GTF文件来源；
feature:特征类型，例：外显子，转录本，mRNA和5’UTR；
start:起始位置；
end:终止位置；
score: 组装转录本的可信度打分；
strand:转录本所在的正负链信息；
frame:CDS特征，StringTie不使用该信息，所以其结果用”.”表示；
attributes:该特征的属性，包括基因id，转录本id，外显子个数，read coverage，FPKM和TPM等。

# featurecount定量
# featrueCounts已经整合到Subread软件中，可用于对基因、外显子、启动子等基因组特征进行read counts计数。
# 可在SourceForge Subread package或Bioconductor Rsubread package中获得（http://subread.sourceforge.net/）

## 安装(解压即用)
wget https://sourceforge.net/projects/subread/files/subread-2.0.1/
tar zxf subread-2.0.0-linux.tar.gz

# 输入文件为 比对生成的bam文件
featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam

主要参数：
-p 指定按照f ragments进行计数，双端测序时使用
-t 指定feature type类型，默认为exon
-a 参考基因组的注释文件
-o 输出文件
input_file1[input_file2]... 与参考基因组比对后的bam文件

featureCounts运行完成后主要生产2个文件：*.txt和*.txt.summary。*.txt.summary是对reads的统计结果.
结果文件共分为7列，分别为：
Geneid：基因ID；
Chr：基因的各个外显子所在的染色体号；
Start：基因的各个外显子起始位置；
End：基因的各个外显子终止位置；
Strand：基因各个外显子所在正负链信息；
Length：长度；
*.sort.bam：比对到该基因的read counts数；